Pip介导铜绿假单胞菌吩嗪基因簇phz2的表达

[目的]为了确定铜绿假单胞菌调控因子Pip对两个不同吩嗪合成基因簇(phz1和phz2)的具体调控方式与可能的调控机制.[方法]根据基因比对结果,采用同源重组技术构建Pip调控因子缺失突变株PA-PG以及克隆ip基因作互补分析;再以已构建的吩嗪基因簇缺失突变株PA-Z1G和PA-Z2K为受体菌,构建突变株PA-PD-Z1G和PA-PG-Z2K,测定并比较野生株及相关突变株的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素的合成量,推定Pip对两个不同吩嗪合成基因簇的调控方式.[结果]在GA培养基中,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都比野生型明显减少;互补分析显示,突变株PA-PG的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素都显著提高并恢复到野生株PAO1水平;突变株PA-Z1G的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量因Pip缺失而显著减少;而突变株PA-Z2K的吩嗪-1-羧酸和绿脓菌素合成量在Pip缺失后仍保持不变.[结论]初步推定,转录调控因子Pip对铜绿假单胞菌吩嗪合成代谢的确具有促进作用;Pip通过正向调控吩嗪基因簇phz2的合成功能实现对吩嗪合成代谢的调控.     

云南阳宗海酵母菌种群结构及产胞外酶测试北大核心CSCD

【目的】研究阳宗海酵母菌种群结构,分析生物因子及非生物因子对酵母菌种群分布的影响;测试阳宗海酵母菌产胞外酶活性。【方法】水样用醋酸纤维素滤膜过滤,原位培养分离酵母菌;梯度稀释法分离土样和底泥样品;对分离得到的菌株进行DNA提取和测序,分析26S rDNA的D1/D2区域,并结合形态及生理生化指标进行鉴定;用产酶筛选培养基对分离得到的酵母菌进行产胞外酶活性测试。【结果】共分离得到201株酵母菌,鉴定分属于15个属48个种,其中包括10个潜在的新种;普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans),库德里阿兹威氏毕赤酵母(Pichia kudriavzevii),胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa),Cryptococcus podzolicus是优势种;15.9%的酵母菌具有产胞外酶活性,主要是脂肪酶和淀粉酶。【结论】阳宗海酵母菌有较为丰富的多样性,人为活动对阳宗海酵母菌分布影响较大,其次浊度、电导率也是影响酵母菌种群分布的重要因素;阳宗海产胞外酶酵母菌可能参与湖泊生态系统的自然循环。     

重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

内蒙古天然草原不同放牧压力下亚洲小车蝗的食性及营养生态位（英文）

植物表皮蜡质中的饱和链烷作为内源指示剂广泛用于评价放牧家畜的食性和食量, 但用于天然草原蝗虫食性的评价研究较少。为了探讨天然草原蝗虫的食性及其生态位变化, 本研究以内蒙古天然草原为研究对象, 于2003年7-8月沿降水梯度选择3种典型植物群落（小针茅Stipa klemenzii、 羊草Leymus chinensis和大针茅Stipa grandis群落）, 在每个植物群落不同放牧压力下小区随机做20个植被样方, 样方内植物齐地面刈割, 测定其地上生物量和物种多样性, 取主要植物种测定其链烷模式, 同时采集放牧小区优势蝗虫种亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus的粪便, 测定其链烷模式, 运用链烷技术评价蝗虫的食性及其营养生态位。结果表明： 不同植物群落中优势牧草种类及其比例不同, 其链烷模式存在种间差异, 链烷技术可以评价亚洲小车蝗的食性。亚洲小车蝗的食性在不同植物群落及不同放牧压力下存在显著的差异, 在羊草和大针茅群落中, 亚洲小车蝗是禾草采食者, 主要采食羊草和糙隐子草Cleistogenes squarrosa, 且与绵羊的营养生态位重叠指数较低, 分别为0.0619和0.0172; 在小针茅群落中亚洲小车蝗是杂类草采食者, 主要采食无芒隐子草Cleistogenes songorica、 猪毛菜Salsola collina和小针茅, 且与绵羊的营养生态位重叠指数较高, 达到0.1815。因此, 放牧不仅改变了群落的植物种类组成, 而且直接影响了亚洲小车蝗的食物组成, 二者对食物资源利用存在一定程度的竞争。     

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

白念珠菌铁通透酶基因CaFTH1的功能研究

[目的]白念珠菌CaFTH1是一种铁通透酶编码基因.为了研究CaFTH1对胞内铁代谢和液泡功能的影响,构建fth1△/△单基因缺失菌株和fth1△/△fet33△/△双基因缺失菌株.[方法]利用生物信息学软件对CaFTH1进行序列比对和分析;通过实时荧光定量PCR技术研究铁离子丰度对CaFTH1表达的影响;利用PCR介导的同源重组方法构建基因缺失菌株;利用原子吸收光谱方法测定基因缺失菌株胞内铁含量的变化,并对基因缺失菌株在缺铁条件和菌丝诱导条件下的生长状况进行研究;通过代谢转换实验,研究CaFTH1对细胞液泡功能的影响.[结果]序列比对结果表明白念珠菌CaFth1蛋白属于铁通透酶Ftr1超家族,与酿酒酵母液泡膜蛋白ScFth1具有最高的同源性.铁匮乏条件会诱导CaFTH1的表达,而富铁条件则会抑制其表达.白念珠菌CaFTH1的缺失会导致胞内铁含量的降低,fth1△/△突变菌株基础上CaFET33的缺失则会进一步降低胞内铁含量.在缺铁条件下,fth1△/△fet33△/△双基因缺失菌株在一定程度上表现出代谢转换能力的缺陷.另外,在某些固体菌丝诱导培养条件下,fth1△/△fet33△/△缺失菌株菌落表面形成褶皱能力显著增强;而在液体菌丝诱导条件下,则表现为增强的菌丝聚集能力.[结论]CaFTH1是一种低铁应答基因,在维持白念珠菌胞内铁离子稳态及液泡功能方面具有重要作用.CaFTH1和CaFET33基因的双缺失会对白念珠菌的菌落形态和菌丝聚集产生影响.     

多粘类芽胞杆菌SC2基因敲除体系的建立

摘要:【目的】建立多粘类芽胞杆菌SC2 的基因敲除体系。【方法】利用电转化把温敏型自杀质粒pRN5101导入到多粘类芽胞杆菌SC2中。采用基因重组技术敲除SC2 中的多粘菌素基因E(pmxE),得到突变株SC2-E。利用抗细菌性能检测和高效液相色谱分析合成多粘菌素的能力,来证实pmxE基因是否被敲除。【结果】成功构建了多粘类芽胞杆菌SC2 的基因敲除体系。pRN5101转入SC2后能够在28℃复制,39℃自杀。突变株失去了合成多粘菌素的能力,成功敲除pmxE基因,验证了此体系的可用性。【结论】首次构建了多粘类芽胞杆菌的基因敲除体系,拓展了pRN5101的使用范围,为研究多粘类芽胞杆菌的基因功能提供了高效的遗传操作工具。     

桑疫病病原拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化北大核心CSCD

【目的】从健康桑树内生菌中分离获得对桑疫病病原菌(Pseudomonas syringae pv.mori)具有显著拮抗作用的菌株,优化其产生抑菌活性物质的发酵条件,为其生防利用奠定基础。【方法】从严格表面消毒的桑树根茎中分离内生菌,采用平板划线法纯化内生菌,用抑菌圈法筛选拮抗菌;根据菌株的形态与培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析对其进行鉴定。通过单因素试验和正交设计试验优化培养基组分及发酵条件。【结果】从健康桑树中分离获得内生菌77株,其中,编号为SWg2的菌株对桑疫病病原菌具有强而稳定的抑制作用。菌株SWg2的形态与培养特征、生理生化特性和泛菌属(Pantoea sp.)相符,而16S rDNA序列分析结果显示它与成团泛菌(P.agglomerans)的亲缘关系接近。研究表明其最佳发酵配方和培养条件为:甘油(2.00%)、硝酸铵(2.00%)、KH2PO4(0.10%)和MgSO4·7H2O(0.15%),起始pH为7.5,装瓶量20 mL/100 mL,最适培养温度为28℃,转速为170 r/min,种子液接种量为4%,摇瓶培养5 d。【结论】经鉴定,对桑疫病病原具拮抗作用的桑树内生菌SWg2为成团泛菌(P.agglomerans),命名为成团泛菌SWg2。对其发酵条件进行优化后对桑疫病病原菌显示出更强的拮抗作用。     

球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK102 纤维素酶基因及其表达条件

[目的]生物质的利用是当前生物技术研究的一个热点.本小组分离到一株高效降解纤维素球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK102,本文拟探索研究此菌的纤维素酶表达系统并寻找影响酶基因表达的关键因素.[方法]通过对NK102测序,本文界定了球毛壳菌NK102的主要纤维素酶编码基因,使用数字基因表达谱升级版(RNA-Seq)的方法得到纤维素酶基因的表达差异,然后观察了营养、物理条件下纤维素酶基因表达和酶活性变化的情况.[结果]发现随着培养时间的延长,纤维素酶基因整体上表达量升高.在所选基因中,外切葡聚糖酶、纤维二糖脱氢酶和内切葡聚糖酶基因(cbh1,cdh和egl1)的表达量最高.糖代谢的负调控因子ACE I和CreA的随时间表达量均降低,而Hap2/3/5复合体的表达量反而升高.之后检测了不同碳源培养基对纤维素酶基因表达量和酶活性的影响,发现葡萄糖为强阻遏因子,纤维二糖为其诱导物,而山梨醇没有影响.特别是,我们发现光照也影响纤维素酶基因的表达,黑暗条件明显抑制酶基因的表达.[结论]转录组学的方法可以初步探索纤维素酶表达的规律,酶基因的表达受到营养、物理条件的影响.本研究为揭示球毛壳菌降解纤维素分子机理和阐释生物质糖代谢途径提供了有用参考.     

五种假单胞菌的分离鉴定及其生物活性

【目的】从湖南长沙市采集到的土样中分离假单胞菌并进行归类,研究各菌株抑菌和抗肿瘤生物活性,以丰富假单胞菌菌种资源并为微生物次级代谢物的挖掘奠定基础。【方法】采用大蜡螟诱集法诱集分离假单胞菌,结合形态观察、生理生化特征和16S rRNA基因序列同源性分析,鉴定并归类各细菌,通过平板扩散法、对峙培养法和肿瘤细胞毒性试验分别研究各菌株抑制细菌、拮抗真菌和抗肿瘤细胞等生物活性。【结果】从湖南长沙市郊区菜地、林地中分离得到5株假单胞菌,归类并命名为Pseudomonas protegens CY01、绿针假单胞菌CY02(Pseudomonas chlororaphis CY02)、栖稻假单胞菌CY04(Pseudomonas oryzihabitans CY04)、Pseudomonas sp.CY05和恶臭假单胞菌CY06(Pseudomonas putida CY06)。P.protegens CY01和P.chlororaphis CY02对枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较好的抑菌效果,P.chlororaphis CY02对水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)具有良好的拮抗作用,对小鼠黑色素瘤细胞B16具有较强的细胞毒性。【结论】分离得到的P.chlororaphis CY02,在抑制病原细菌、拮抗水稻稻瘟病菌和抗肿瘤细胞等方面具有显著效果。